范占彬

隆尧县医院普外科 河北省隆尧县 055350

摘要：目的：探讨环氧合酶抑制剂NS398对胃癌细胞株SCG7901的生物学行为的影响。方法：用MTT、DNA梯度降解试验及流式细胞仪等方法，研究NS398对胃癌细胞株SCG7901的抑制增殖、促进凋亡作用。结果：NS398对胃癌细胞株SCG7901产生明显的生长抑制作用，且表现为剂量依赖性(F=36.598，P<0.01)；DNA梯度降解试验、流式细胞仪分析NS398浓度依赖性地诱导了胃癌细胞株SCG7901凋亡(F=11.342，P<0.01)，且凋亡与细胞周期受阻有关(F=22.445，P<0.01)，主要阻止在S/G2期。结论：NS398对胃癌细胞株SCG7901具有显著浓度依赖性的体外生长抑制、诱导凋亡、阻滞DNA合成作用。

关键词：环氧合酶-2；非甾体类抗炎药NS398；胃癌细胞株SCG7901

Effects of NS398 on the SGC7901 Gastric Cell Line

Fan zhan bin, Li she min, Yuan zhan guo 

General Surgery of  Longyao County Hospital, Hebei Province Longyao County 055350

Abstract：Objective：To investigate the mechanism of the effects that NS398 exerts on the SGC7901 Gastric Cell Line in vitro. Methods：The effects of NS398 on the SGC7901 were investigated in vitro with MTT，DNA ladder and flow cytometry (FCM). Results：NS398 had obviously inhibited the proliferation shown by MTT and the effects were time-and dose-dependent. The results of DNA ladder and FCM explained that NS398 could induce SGC7901 cells' apoptosis in vitro and apoptosis was associated with cell cyclic trap, mainly the checkpoint from S phase to G2 phase being blocked. Furthermore, all the about results showed statistical significance. Conclusion NS398 has the effects of inhibiting proliferation, promoting apoptosis and blocking the replication of DNA on SGC7901 in vitro and the effects are apparently dose-dependent.

Keywords: COX-2; NS398; SGC7901

环氧合酶-2(COX-2)的抑制剂对人类多种恶性肿瘤如前列腺癌和胰腺癌细胞有抑制增殖和诱导凋亡的作用，非甾体类抗炎药(NSAIDs)具有阻断恶性肿瘤发生发展的作用，其靶位点在于可以选择性地抑制COX-2的表达[1]。本实验采用COX-2选择性抑制剂-氮-2,环己氧-4,硝基苯-甲基磺胺(NS398)，观察其对SCG7901的增殖和凋亡的影响,旨在为临床应用NSAIDs应用于胃癌提供依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂 NS398纯品购自(美国Sigma公司)，培养基RPMI1640购自Sigma公司，RNase、1 kb DNA ladder、碘化丙啶(PI)试剂购自购自晶美公司(深圳)。

1.2细胞系 SGC7901细胞株由中国协和医科大学细胞中心提供，本实验室常规传代培养， 10%胎牛血清, 37℃，5% CO2培养箱中培养，均贴壁生长。

1.3细胞生长曲线-MTT法 采用96孔板,每孔接种细胞104~105个，37℃，CO2孵箱中培养12~24h后用不同浓度的NS398使其终浓度分别为0、50、100、150、200μmol/L，处理细胞,取不同时间(0、12、24、36、48、72h)，设不接种细胞的空白对照和只含0.1%二甲基亚砜(DMSD)的阴性对照组，每种浓度平行3个复孔。作用指定的时间段后弃去培养基，给每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，继续孵育4h，终止培养。吸弃孔中的培养上清，每孔加入150μL DMSO，振荡10min，在酶联免疫检测分析仪测定各孔吸光度值(A)，并以此绘制生长曲线，计算抑制率。抑制率(% ) =(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。

1.4 DNA梯形电泳检测细胞凋亡 取指数生长期的SGC7901的单细胞悬液，分别以每瓶104~105个细胞接种于25cm2培养瓶内，常规培养24h，更换实验用培养液(含不同浓度的NS398)培养72h， 0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞；用酚和氯仿抽提法提取DNA，取DNA产物10μL，在1.2%琼脂糖凝胶行电泳检测，电压100V、3h，溴乙锭染

色分析，紫外灯下拍照。

1.5流式细胞仪(FCM)检测细胞周期及细胞凋亡PI染色法：将终浓度为0、50、100、150、200μmol/L的NS398与SGC7901作用24h后, 0.25%胰酶消化，收集制成105个细胞的单细胞悬液，收集六孔板内细胞制备单细胞悬液。PBS洗2次, 70%冰乙醇固定16h。检测时以PBS洗次，加入200u L RNaseA (1g/L)，37℃水浴30 min，再加P

100ug/mL染色液避光反应30min，上机检测。

1.6统计学分析 所有数据输入SPSS12.0统计软件进行方差分析

2 结果

2.1 NS398对SGC7901细胞增殖和凋亡的影响 不同浓度NS398作用于SGC7901细胞不同时间后，分别根据其吸光度计算各组细胞的生长抑制率，结果如表1，绘制细胞生长抑制曲线如图1所示。统计学分析结果组间结果差异有统计学意义(F=35.984，P<0.01)。

表1不同浓度NS398在不同时间的Ishikawa细胞的抑制率(% )

NS398(μmol/L) 0 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h

0 1.20±0.15 1.19±0.22 1.22±0.20 1.26±0.19 1.30±0.15 1.45±0.18

50 1.21±0.13 7.25±0.52 12.58±0.45 15.45±1.26 28.55±0.36 33.63±0.53

100 1.23±0.14 9.89±0.66 16.53±1.35 26.16±0.32 38.43±0.63 41.27±0.73

150 1.25±0.30 12.13±0.63 21.08±1.12 31.62±0.82 48.13±1.32 61.63±1.58

200 1.32±0.18 18.58±0.35 28.98±1.29 41.23±0.35 52.53±1.63 70.32±0.14

 

2.2 100umol/LNS398作用于SCG7901不同时间后DNA电泳图有不同亮度的特征性凋亡梯形图，如图2所示。不同浓度的NS398处理SCG7901细胞24h后，流式细胞仪检测各处理组G2期相应出现凋亡峰， 0、50、100、150、200umol/L各浓度的NS398处理后细胞的凋亡率(% )分别为1.4±0.32、12.5±2.17、32.1±5.08、57.2±0.83、76.6±3.59。统计学分析不同浓度处理组间差异有统计学意义(F=12.414，P<0.01)。

图2 DNA电泳检测细胞凋亡图

 

2.3细胞周期分布情况 SCG7901细胞分为NS398处理组和未处理对照组，以不同浓度的NS398处理SCG7901细胞24h后，经流式细胞仪检测细胞在各周期中所占百分率的比较如表2所示。表明不同细胞周期组间差异有统计学意义(F=21.315，P<0.01)

表2不同浓度NS398组SCG7901细胞在各周期分布比例的比较(% )

NS398(μmol/L) G0期 G1期 S期 G2期

0 7.13±1.14 42.17±0.56 24.12±0.25 26.58±0.29

50 6.15±0.85 55.35±0.45 21.42±0.35 17.08±0.38

100 5.05±0.72 65.82±0.36 16.23±1.28 12.9±0.35

150 4.83±0.64 73.62±0.53 13.26±0.77 8.29±0.76

200 2.45±0.18 87.16±0.42 10.23±0.34 0.16±0.05

图2不同浓度NS398组SCG7901细胞在各周期分布比例

3　讨论

随着细胞生物学、分子生物学的发展,炎症介质前列腺素(PGs)逐渐被认为在肿瘤细胞信号途径中发挥着重要的作用，COX-2作为PGs的最重要合成催化酶在肿瘤中的表达也受到普遍关注，多数认为COX-2表达与肿瘤的发生、发展、侵袭转移、对放化疗的敏感性和预后密切相关[2-3]。非甾体类抗炎药能选择性抑制COX-2的表达，从而抑制PGs作用，达到抑制肿瘤生长的作用，近年来胃癌发病率有上升趋势，COX-2选择性抑制剂NS398对体外培养的胃癌细胞的作用效果研究渴望能为临床治疗胃癌开辟新的思路。

 研究中给予不同浓度的NS398从细胞水平观察胃细胞的COX-2被抑制后对细胞生物学特性的影响、细胞增殖和细胞凋亡、以及细胞周期分布状况。MTT检测不同浓度的NS398以时间、剂量依赖性方式抑制SCG7901细胞增殖,差异有统计学意义(F=36.598，P<0.01)，当NS398浓度为200umol/L，作用72h时抑制效果最显著，抑制率达70.32%。200μmol/L的NS398作用于SCG7901细胞后DNA电泳图也可以看出很明显的特征性梯形图谱，随着作用时间的延长条带越来越明显，以作用72h时亮度最强；流式细胞仪检测细胞凋亡结果也表面NS398作用细胞后在24h内细胞凋亡具有浓度依赖性，随着作用浓度增加，凋亡率升高(F =11.342，P<0.01)。因此，可以肯定NS398体外对胃癌细胞具有时间和浓度依赖抑制增殖、促进凋亡的作用。另外,NS398作用细胞后流式检测细胞周期分布结果也表明各处理组出现G2峰，并且呈现剂量依赖性。不同浓度NS398作用SCG7901细胞24h后，细胞周期亦发生改变： 0、50、100、150、200umol/LNS398处理SCG7901细胞24h后，主要为G1/G0期百分率依次增加，而S期和G2/M期百分率均明显降低，细胞分化停滞于G2期，即作用于细胞周期的S/G2点，NS398对SCG7901细胞周期的干预作用主要表现在抑制细胞DNA的合成后期；且其引起周期阻滞的效应在24h呈现剂量依赖性(F=22.445，P<0.01)。有关COX-2与胃癌关系的研究报道很多，表现COX-2在胃癌中强表达，且与胃癌的恶性生物学特性正相关，与预后呈负相关，而我们用特异性的COX-2酶抑制剂NS398作用于胃癌细胞的体外研究试验表明，NS398可以体外抑制SCG7901细胞的增殖、促进凋亡、诱导其周期停滞。因此，我们认为COX-2作为胃癌药物治疗新的靶基因，NS398对其有较好的抑制作用，结合NS398副反应小的特点，其作为临床提高胃癌的综合治疗效果、化疗甚至预防治疗的辅助药物将有广阔的应用前景。

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