中国医学创新官方 国内统一刊号:CN 11-5784/R
国际标准刊号:ISSN 1674-4985
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中国医学创新
《 中国医学创新 》
级别:国家级     分类:医学    周期:旬刊
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国内刊号:CN 11-5784/R
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期刊信息
期刊名称:中国医学创新
主      编:师帅
出版周期:旬刊
出版地区:北京市
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范文-大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定-中国医学创新

 大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定

张爱霞1,2
1.梅州,嘉应学院生命科学学院,广东省梅州514015
2.中山大学中山医学院干细胞与组织工程中心510080
摘要:【目的】建立大鼠骨髓间质干细胞(BMSCs)的分离培养方法,并进行形态学观察、表型和多向分化能力的检测鉴定。【方法】采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,显微镜下形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD44、CD45,并诱导大鼠BMSCs向成骨和成脂分化。【结果】分离培养的细胞以梭形细胞为主,呈漩涡状生长。CD29、CD44 均呈阳性表达,而CD45呈阴性。成脂成骨诱导后,油红O和茜素红S染色均呈阳性。【结论】全骨髓贴壁培养法分离培养的细胞具有间质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能。
关键词:骨髓间质干细胞;分离培养;鉴定
BMSCs作为多能干细胞的一种,由于其取材方便,具有多向分化潜能,有较弱的免疫抗原性,体内植入反应较弱,正逐渐受到学者们的广泛关注。BMSCs具有很强的自我更新能力,可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等[1-2]中胚层来源的细胞。大量的研究证实了骨髓间质干细胞具有惊人的可塑性,它可以超越胚层的界限而具有广泛的分化潜能。除了向间质组织分化外,BMSCs还可跨越胚层限制向外胚层的神经元、神经胶质细胞等[3]外胚层分化,向胰岛样细胞[4]、肝细胞[5]等内胚层来源的细胞分化。BMSCs已成为重要的组织工程种子细胞,并且BMSCs的细胞增殖分裂模式使外源基因易于导入和表达,成为细胞替代治疗、基因治疗和组织工程的理想选择[6-8],具有重要的临床应用前景。
在骨髓中,BMSCs占骨髓有核细胞总数的0.001%~0.1%,含量极低。体外分离培养BMSCs对实验研究和应用显得至关重要。本实验应用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs,并观察大鼠BMSCs的生物学特性及其成骨、成脂分化潜能,为体内外研究应用寻找良好的种子细胞提供实践基础。
 
1 材料与方法
1.1 实验动物
4~6周龄SPF级SD大鼠,雌雄不限,体重100~150 g,购自中山大学中山医学院实验动物中心。
1.2 实验试剂
L-DMEM培养基、H-DMEM培养基均购自美国GIBCO BRL公司;胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶均购自Hyclone公司;Vitamin C、地塞米松、牛胰岛素均购自Sigma公司;β-甘油磷酸钠购自Calbiochem公司。兔抗大鼠单克隆抗体CD29-FITC、CD44- FITC、CD45- PE-Cy5购自BD phamingen 公司。
1.3 大鼠BMSCs的体外分离、培养与纯化
取SPF级3~4周龄SD大鼠,断颈处死,75 %酒精浸泡5 min。无菌条件下分离大鼠双侧股骨,并彻底清除附着其上的肌肉组织,去除两端骨骺,用含10%胎牛血清的L-DMEM间质干细胞培养液反复冲洗骨髓腔,收集细胞,1 100 r/m in 离心5 m in, 弃去上清及脂肪层。以2×105 cells/cm2的密度接种于25 cm2培养瓶中,置于37℃含体积分数为5%CO2及饱和湿度的恒温培养箱中培养。培养48h后首次换液,去除非贴壁细胞,以后每3 d 换液1次,每天在倒置相差显微镜下观察细胞的形态及生长情况。待细胞达到80%~90%融合时,用0.25%胰蛋白酶液消化按1∶3比例进行传代培养。
1.4 流式细胞仪检测细胞表面标记
收集第3代细胞,调整细胞密度为1.0×106 个/ml ,装入1.5 ml的EP管中,每管1 ml,1100 r/min离心4 min,弃上清。每管加入100 μL PBS,混匀,分别加入CD29-FITC、CD44- FITC、CD45- PE-Cy5兔抗大鼠单克隆抗体1 μL(0.5-1μg/106细胞),混匀。37 ℃避光孵育20 min后,每管加入1 ml PBS,1100 r/min离心4 min,弃上清,再重复洗2遍,以除去未结合抗体。0.5 ml PBS 重悬细胞,流式细胞仪进行检测分析。同时每管样品设立同型阴性对照。
1.5 体外诱导大鼠BMSCs 成骨和成脂分化
1.5.1 成脂分化及油红O染色鉴定
取第3代的大鼠BMSCs接种于六孔板,加入含1umol/L的地塞米松,0.5mmol/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methyl-xanthine, IBMX),10mg/L的牛胰岛素,100mmol/L的消炎痛(indomethncin),10%FCS的H-DMEM诱导3天,再用含10mg/L的牛胰岛素,10%FCS的H-DMEM处理1d,镜下观察细胞形态的变化和生长情况。成脂诱导后的细胞用PBS洗涤3次,10%多聚甲醛固定10min,油红O染色5-10min,60%异丙醇稍洗去多余染液,蒸馏水洗,Mayer氏苏木素浅染核,1%盐酸水稍分化,水漂洗10min。于倒置相差显微镜下观察。
1.5.2 成骨分化及茜素红S染色
取第3代的大鼠BMSCs接种于六孔板,加入成骨细胞诱导液(含10-7mol/L地塞米松,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,50g/ml Vitamin C)2ml,置培养箱中培养。诱导分化18 d后,吸去成骨细胞诱导液,用PBS洗涤3次,然后加入适量的茜素红-S染液染10-15 min,显微镜下观察结果。
2 结果
2.1 BMSCs的形态学观察
原代培养时,骨髓细胞接种于培养瓶后,细胞呈圆型,悬浮于培养液中。培养24h后即有细胞贴壁,换液后可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长,第4~5d可形成分散的细胞集落,细胞形态不一,梭形细胞为主,见图1A。第8~9d细胞呈集落生长,细胞间相互紧密贴附生长,沿胞体长轴有序排列,呈螺旋状或漩涡状,可达80%~90%融合,见图1B。消化传代后,传代细胞12 h完全贴壁生长,3~4d天可传代1次。传代至第3代的细胞形态均一,呈梭形生长,见图1C。
         
 
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图1 不同时期骨髓间质干细胞的形态学观察(×100)
2.2 BMSCs表面标记物的表达
流式细胞仪检测结果显示,培养的第3代大鼠BMSCs CD29、CD44表达阳性,而CD45呈阴性,见图2。
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图2 大鼠骨髓间充质干细胞表面标志物的表达
2.3 BMSCs成脂成骨诱导分化及鉴定
BMSCs加入脂肪诱导液诱导2周后,细胞中有大小不等的脂肪滴出现,细胞逐渐由原来的梭形变为圆形或多角形,经油红O染色,苏木素复染核,镜下观察可见脂滴为橙红色,胞核为蓝色(图1A)。BMSCs经成骨诱导液诱导2周后,细胞转变为多角形细胞,呈多层重叠生长,可观察到较大的细胞结节,有明显的钙沉积,茜素红S染色后镜下可见散在大量橘红色的钙结节,为茜素红与钙盐形成的橘红色的复合物(图1B)。        
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               A                               B
图3 大鼠骨髓间质干细胞成脂成骨诱导分化鉴定 
A:成脂油红O 染色(×200) B:成骨茜素红S染色(×100)
 
3 讨论
骨髓间质干细胞是骨髓内除造血干细胞之外的另一类干细胞,是骨髓造血微环境的重要组成部分。BMSCs在全骨髓中比例很低,只占骨髓有核细胞总数的0.001%~0.01% [9]。目前已经建立了多种体外分离培养BMSCs的方法,主要有全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法,不同的方法具有不同的优缺点。密度梯度离心法根据骨髓其他细胞与BMSCs的相对密度不同,筛选出纯度较高的BMSCs,但改变了BMSCs的外界微环境,影响细胞活力。流式细胞术和免疫磁珠法可获得纯度较高的BMSCs,但价格昂贵,且对细胞活性影响较大[1,10]。全骨髓贴壁培养法基于BMSCs的粘附特性,是获得这种细胞的最简单方法。本实验采用的是全骨髓贴壁培养法,将骨髓细胞直接进行贴壁培养,用L-DMEM + 10% FBS 作为基本培养基,通过反复、多次换液去除未贴壁的造血干细胞,获得贴壁生长的BMSCs,通过传代进行纯化和扩增培养。研究显示,体外培养的BMSCs,在形态上呈纺锤形成纤维细胞状,能贴壁生长,呈螺旋状或漩涡状[11]。本研究也证实了上述观察结果。
与造血干细胞不同,BMSCs的表面标志物具有非专一性[12],它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。目前,国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的鉴定人来源BMSCs的3条最低标准[13]:①对塑料底物的贴附特性。②CD105、CD73及CD90等阳性表达率≥95%,而CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19、HLA-DR等的阳性表达率≤2%。③具有多向分化潜能。本实验应用流式细胞仪对培养的第3代大鼠BMSCs的CD29、CD44和CD45表面抗原标志进行了鉴定,结果显示CD29和CD44间充质干细胞表面标志抗原表达阳性,而CD45造血干细胞表面标志抗原表达阴性。
本研究利用骨髓全贴壁培养法成功分离培养了大鼠BMSCs,所得细胞具有间质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能,这将为进一步的实验研究和应用打下坚实的基础。
 
参考文献:
[1]李晓峰,赵劲民,苏 伟,等. 大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2011,15(10):1721-1725.
[2]邓海燕,曾俊义,魏云峰,等. 微小RNA-1慢病毒载体介导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究[J]. 中华老年心脑血管病杂志,2013,15(5):514-520.
[3]王舒阳,韩瑞,张广宇,等. Oct3/4在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞神经分化中的作用中国病理生理杂志[J]. 2012,28(3):385-392.
[4]滕春燕,于庭,刘爱忠,等. 骨髓间充质干细胞诱导的胰岛样细胞治疗大鼠胰腺损伤[J]. 中国老年学杂志,2009,29(7):799-802.
[5]徐洪军,关晓辉,关兴卓. 大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2008,12(43):8481-8484.
[6]徐彩霞,项鹏,陈蕊,等. 绿色荧光蛋白标记骨髓间质干细胞示踪技术在体外构建组织工程骨中的应用研究[J]. 生物医学工程学杂志,2011,28(1):121-137.
[7]陈艳,宣爱国,方继荣. Brn-4基因修饰骨髓间质干细胞移植对老年痴呆鼠学习记忆的影响[J]. 中国老年学杂志,2012,32(1):82-85.
[8]朱从元,李建平. 间充质干细胞联合胰岛细胞治疗1型糖尿病研究进展[J]. 世界华人消化杂志,2011,19(24): 2546-2550.
[9]Minguell JJ, Erices A, Conget P. Mesenchymal stem cells[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2001, 226(6): 507-20.
[10]赵 林,冯智慧,焦淑贤,等. 全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2011,15(32):5923-5927.
[11]王翠艳,魏芳晶,阴淑莹,等. 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定[J]. 中国老年学杂志,2013,33(5):1086-1088.
[12]Lee,R.H, Kim,B, Choi,I. et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue[J]. Cell Physiol Biochem, 2004, 14(4-6):311-24.
[13]Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006, 8(4): 315-7.
作者简介:
张爱霞,女 1977-10,山东东营人,汉,博士,讲师,研究方向:干细胞分化机理