杨露1  谢晓芳2 胡荣2

1 成都中医药大学图书馆  四川  成都  610075

2.成都中医药大学药学院测试中心 四川 成都 611137

 

基金项目：四川省中医管理局课题（编号：2012-E-042）

 

作者简介：杨露（1975.10——）女 ，汉族，籍贯：重庆，职称：实验师，硕士，研究方向：中药药理。

摘要 目的：研究麻黄附子细辛汤与抗生素联合应用对抗生素的增效作用。方法：将各组培养基分别接种肺炎克雷伯菌后37℃培养过夜，空白组不接种细菌，每12小时取出计数，计算活菌数。结果：中药复方组12h时发现细菌逐渐生长，直至培养120h后细菌浓度才逐渐下降，直至培养180h时细菌浓度保持不变,头孢唑林组培养12h时细菌数逐渐减少，到60h时细菌减少的趋势停止,中药复方联合头孢唑林组培养12h时细菌数逐渐减少，并在培养144h时各组细菌菌无生长迹象,替加环素药物干预后细菌数急剧下降，但是直到观察结束仍有部分细菌存活,阴性组细菌随着培养时间的逐渐延长呈现缓慢生长趋势，空白组无细菌生长.结论：麻黄附子细辛汤联合抗生素具有更明显的抗菌效应，可能与它激活耐药细菌生长有关。

关键词：麻黄附子细辛汤 肺炎克雷伯菌 抗生素  细菌生长

抗生素的广泛使用甚至滥用导致细菌耐药性问题日趋严峻，虽然针对耐药菌研发新型抗生素的工作从未停止，但是抗生素资源是相对有限的，新型抗生素的开发速度远不及细菌耐药性出来的速度。肺炎克雷伯菌（Klebsiella  pneumoniae  KP）是一种存在于人体上呼吸道和肠道的革兰氏阴性杆菌，近年来已成为引起社区获得性感染和医院感染的最重要病原菌之一，[1]由于大量抗生素的广泛使用，KP已成为产超广谱β-内酰胺酶的代表菌种，耐药性问题日益突出[2]。有研究表明，KP对头孢唑林的耐药率达33.5%[3]。麻黄附子细辛汤是汉代张仲景的《伤寒论》的经典方剂，由麻黄、附子、细辛三味药组成，具有助阳解表、温化寒饮之功效［4］，组方严谨，日本岛根县疑难病研究所的龟井勉主任在日本《医学论坛报》上报告称，在治疗老年人耐药菌感染时，用麻黄附子细辛汤取得较好效果。国内也有报道用麻黄附子细辛汤治疗肺炎迁延不愈，其中不乏住院后感染的老年病例 ，症状与克雷伯菌感染相似[5]。多项研究已证实该方具有明显的抗病毒、消炎，刺激免疫等作用，但其抗菌的机制尚未明确，近年来有文献［6］指出“休眠”并非是细菌耐药的唯一原因，缓慢生长的细菌耐药性虽然稍低于“休眠”细菌，但由于其数量庞大，是造成抗生素失效以及感染的复发的主要原因。于是我们猜想：麻黄附子细辛汤发挥抗菌效应是否与在一定程度上促进耐药菌生长有关？为了在实验室证实这一情况，为临床用药提供科学依据，我们做了研究，具体如下：

1、材料

1.1药品及菌种

   麻黄（内蒙古  批号121001）、细辛（辽宁  批号121102）、附子（四川  批号120801），经鉴定均为正品。肺炎克雷伯菌来源于中国药品生物制品鉴定所，成都中医药大学微生物教研室鉴定、保存。

1.2仪器

   隔水式电热细胞（霉菌）培养箱（常州华冠仪器制造有限公司）、净化工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（深圳市耐美特工业设备有限公司）、自动压力蒸汽灭菌器（上海茸研仪器有限公司）、PL 203型电子天平（瑞士METTLER TOLEDO）。

1.3培养基

M-H液体培养基（杭州微生物试剂有限公司 批号113627）；胎牛血清（郑州佰安生物工程有限公司 批号03514）；营养琼脂（NA，规格：250g，西亚试剂在生物制药有限公司 批号：20120205）、营养肉汤（NB，规格：250ml，上海恒远生物科技有限公司 货号：YH00624）。所有培养基均按产品说明书配制。

1.4抗生素

   头孢唑林（批准文号：国药准字H20045015 生产企业：悦康药业集团有限公司）。

替加环素（批准文号：国药准字H20041889 生产企业：天津百特医疗用品有限公司）。

2、方法

2.1分组

分为麻黄附子细辛汤复方组、中药复方加头孢唑林组、头孢唑林组，空白组（未加药物未接种细菌的空白培养基），阳性组(单纯加入替加环素的培养基)，阴性组(未加药物接种细菌的培养基)

2.2复方提取

将附子、麻黄、细辛分别粉碎成直径小于18μm的超微粉，精密称取12g，6g，6g，冷水浸泡后煎煮两次，合并煎煮液，过滤，浓缩为50mg（生药）/ml。

将0.9%Nacl溶液煮沸灭菌，置于4°C环境中备用，实验时利用经过灭菌的0.9%Nacl溶液将受试样本溶液配制成不同浓度梯度液体。

2.2细菌液的制备

   将肺炎克雷伯菌接种于营养肉汤中，并静置于37℃条件的培养箱中培养24h，随后取出细菌液3ml，利用营养肉汤将细菌液浓度稀释成(0.5-1)×105个/mL密度备用。

2.3活菌计数

将不同组别分别接种肺炎克雷伯菌后混匀，冷却、待凝固后，放入37℃培养过夜，每12小时取出计数，观察对比耐药菌的生长情况。

2.4统计处理

将所得数据输入excel表格中，利用SPSS18.0软件统计分析，独立样本均数间比较采用t-test检验，方差分析前使用Levene检验方差齐性。各组计量资料以x±s 表示，P<0.05时具有统计学意义。

3、结果

3.1各组活菌数的比较

  中药复方组12h时发现细菌逐渐生长，直至培养120h后细菌浓度才逐渐下降，直至培养180h时细菌浓度保持不变。头孢唑林组培养12h时细菌数逐渐减少，到60h时细菌减少的趋势停止。中药复方联合头孢唑林组培养12h时细菌数逐渐减少，并在培养144h时各组细菌无生长迹象. 替加环素药物干预后细菌数急剧下降，但是直到观察结束仍有部分细菌存活，阴性组细菌随着培养时间的逐渐延长呈现缓慢生长趋势，具体见图。

 

 

4、讨论

 我国既是抗生素生产大国，也是抗生素使用大国。相关资料显示，我国年产抗生素原料大约21万吨，其中3万吨用于出口，剩余近18万吨完全由国内市场消化（包括医疗与农业使用），人均年消费量达到惊人的138克（美国仅13克）。由于人类滥用抗生素的结果，现在一代耐药菌的产生只要2年时间，而医药工作者开发一种新的抗生素大约需要10年时间，抗生素的研制速度已经远远跟不上耐药菌的产生速度。耐药菌感染给临床工作带来了极大挑战［7,8］。《cell》［6］杂志曾报道：受到感染的机体组织中细菌对抗生素的敏感性不尽相同，部分生长缓慢的致病菌表现明显的耐药性，“休眠”并非是细菌耐药的唯一原因，缓慢生长的细菌耐药性虽然稍低于“休眠”细菌，但由于其数量庞大，是造成抗生素失效以及感染复发的主要原因。于是针对上述情况我们做一假设：如果某种干预措施能够促进耐药菌的生长，是否可以作为已经被耐药的抗生素继续发挥灭菌作用的前提基础？本研究使用的KP是产超广谱β-内酰胺酶的代表菌种，在用空白组培养基进行细菌活菌计数实验时发现细菌生长缓慢的迹象，这与Basel大学的科学家们的发现具有一致性，验证了“休眠”及生长缓慢的细菌均是细菌耐药性的原因。故我们认为一定程度上加快耐药性细菌的生长速度可能是协助抗生素杀菌的关键环节。

中草药在现代医学预防及治疗细菌感染方面的作用日益受到重视，中药制剂中具有抗菌作用的复方或单方制剂以及中西药配伍制剂正不断得到研究与证实。日本岛根县疑难病研究所的龟井勉主任在日本《医学论坛报》上报告称，在治疗老年人耐药菌感染时，用麻黄附子细辛汤取得较好疗效。近年来国内也屡有报道用麻黄附子细辛汤治疗久不见逾的慢性肺炎、肺梗阻等疾病，诸多国内外报道［9-12］中患者均已经使用（或单独使用）抗生素进行抗感染治疗，但疗效不佳，再使用（或配合使用）麻黄附子细辛汤治疗后取得较好疗效。对于麻黄附子细辛汤实验室的抗菌谱目前研究尚少，于是我们设想：麻黄附子细辛汤发挥抗感染的作用是否与促进耐药菌株的生长有关。

根据这一设想本研究采用产超广谱β-内酰胺酶的代表菌种KP，KP产生耐药性是自身产生灭活酶、外膜孔蛋白的变化、生物膜的产生以及细菌主动外排结构的改变等多种因素共同作用的结果[13]。KP对头孢唑林的耐药率较高，有研究表明，KP对头孢唑林的耐药率达33.5%，故本实验选用头孢唑林为联用抗生素。替加环素是新一代治疗革兰氏阴性菌的有效药 ，文献报道，新一代甘氨酰环素类抗菌药物替加环素对克雷伯菌具有极高的敏感性[14]，故本实验选替加环素为阳性对照。通过不同组别药物接种KP并进行观察，发现头孢唑林组细菌自药物干预后活菌数逐渐减少，但在培养60h后细菌减少的趋势停止，另一组替加环素药物干预后细菌数急剧下降，但是直到观察结束仍有部分细菌存活，这说明余下的细菌耐受了抗生素，导致抗生素不发挥作用；在对中药复方组的细菌进行计数时我们发现培养12h时发现细菌逐渐生长，直至培养120h后细菌浓度才逐渐下降，直至培养180h时细菌浓度保持不变，这一现象说明中药在干预初期引起了耐药菌株的生长，说明部分原先处于“休眠”或者生长缓慢的菌株被激活。在中药复方联合抗生素的组别我们发现培养12h时细菌数逐渐减少，并在培养144h时各组基本无细菌生存迹象，我们推测：联合用药时使原先部分因为“休眠”或者生长缓慢逃过抗生素扼杀的细菌重新激活，随之再将它们灭杀。

总之，麻黄附子细辛汤联合抗生素对临床耐药病菌表现出较为理想的协助抗菌活性，可能是中药激活细菌生长后为抗生素的灭菌提供了更为有利的环境，然而中药是通过何种途径激活“休眠”或者生长缓慢的耐药菌，本阶段尚未进行研究，将作为下阶段的主要课题。

 

参考文献

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