复方苦参乳膏微生物限度检查方法验证
顾建明 张新民
苏州市吴江区中医医院苏州市吴江区第二人民医院 江苏苏州 215221

复方苦参乳膏是我院根据皮肤科凌新民副主任医师治疗湿疹的经验方研制而成的医院制剂，由苦参、蛇床子、地肤子、白鲜皮、紫草、冰片等组成。根据《中华人民共和国药典》2010年版（一部）微生物限度检查法规定，在建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、真菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该制剂的细菌、真菌及酵母菌数的测定和控制菌检查。笔者查阅了有关文献【1】，并进行多次实验，确定了复方苦参乳膏微生物限度的检查方法，更进一步保证了该制剂的质量。
1 实验材料
1.1菌种
大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽胞杆菌[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、黑曲菌[CMCC(F)98003]均由中国药品生物制品检定所提供。
1.2培养基
   营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、甘露醇氯化钠脂琼培养基、PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液等均为北京三药科技开发公司生产。
1.3样品
复方苦参乳膏（批号：20120917、20120918、20120919）
2 方法与结果
2.1 菌液的制备
    接种大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，置于30～35℃培养箱培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，培养24～48小时，然后各用0.9%无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释至每1ml含菌数在50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天至大量孢子产生，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，振摇，洗脱孢子，吸出孢子悬液，（用管口带有薄的无菌棉花能过滤菌丝的无菌吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数在50～100cfu的孢子悬液。
2.2供试液的制备
  称取样品5g加到已灭菌带玻璃珠数粒含聚山梨酯-80 10g、单硬脂酸甘油酯3g的150ml三角烧瓶中，44℃保温后，充分振摇，使供试品溶解，加入80ml预先保温至44℃已灭菌的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液中，充分振摇，使乳化完全，为1:20供试品溶液。
2.3 方法验证
2.3.1菌落计数方法的验证
在预实验中发现本品对细菌、霉菌均有较强的抑菌作用，所以本验证方法采用培养基稀释法。试验组：取1:20供试品溶液0.1ml和含菌量为50～100CFU的金黄色葡萄球菌菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，平行制备2个平皿，置于30～35℃培养箱培养24～48小时计数。取1:20供试品溶液0.1ml和含菌量为50～100CFU的大肠埃希菌菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，平行制备2个平皿，置于30～35℃培养箱培养24～48小时计数。取1:20供试品溶液0.1ml和含菌量为50～100CFU的枯草芽胞杆菌菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，平行制备2个平皿，置于30～35℃培养箱培养24～48小时计数。取1:20供试品溶液0.2ml和含菌量为50～100CFU的白色念珠菌菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，平行制备2个平皿，置于23～28℃培养箱培养48～72小时计数。取1:20供试品溶液0.2ml和含菌量为50～100CFU的黑曲霉孢子菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，平行制备2个平皿，置于23～28℃培养箱培养48～72小时计数。菌液组：取含菌量为50～100CFU的金黄色葡萄球菌菌悬液，取含菌量为50～100CFU的大肠埃希菌菌悬液，取含菌量为50～100CFU的枯草芽胞杆菌菌悬液，分别注入2个平皿，立即倾注营养琼脂培养基，置于30～35℃培养箱培养24～48小时计数；取含菌量为50～100CFU的白色念珠菌菌悬液，取含孢子数为50～100CFU的黑曲霉孢子菌悬液分别注入2个平皿，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置于23～28℃培养箱培养48～72小时计数。供试品对照组：取1:20供试液1ml均匀接种于10个平皿即0.1ml/皿，立即倾注营养脂琼培养基，平行制备2份，置于30～35℃培养箱培养24～48小时计数。取1:20供试液1ml均匀接种于5个平皿即0.2ml/皿，立即倾注玫瑰红钠脂琼培养基，平行制备2份，置于23～28℃培养箱培养48～72小时计数。结果见表1
表1. 菌落计数方法的验证
菌种类型 试验次数 试验组 菌液组 供试品对照组 试验组回收率

大肠埃希菌 1 76 70 0 100%
 2 101 107 0 94.39%
 3 68 71 0 95.77%
金黄色葡萄球菌 1 68 75 0 90.67%
 2 65 67 0 97.01%
 3 71 77 0 92.21%
枯草芽胞杆菌 1 64 68 0 94.12%
 2 88 95 0 92.63%
 3 73 81 0 90.12%
白色念珠菌 1 56 59 0 94.92%
 2 68 66 0 100%
 3 70 73 0 95.89%
黑曲霉 1 67 72 0 93.06%
 2 59 68 0 86.76%
 3 50 56 0 89.7%
2.3.2控制菌检查方法的验证
因本品对细菌有较强的抑菌作用，所以本品控制菌检查验证方法采用培养基稀释法。
2.3.2.1菌液的制备方法
接种大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，置于30～35℃培养箱培养18～24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释至每1ml含菌数在10～100CFU的菌悬液。
2.3.2.2供试液制备
方法同上述2.2供试液制备。
2.3.3铜绿假单胞菌检查方法验证
2.3.3.1试验组 ：取1:20的供试液20ml及10～100CFU的铜绿假单胞菌菌悬液接种至300ml胆盐乳糖培养基，置于30～35℃培养箱培养18～24小时。阴性菌对照组：取1:20的供试液20ml及10～100CFU的金黄色葡萄球菌菌悬液接种至300ml胆盐乳糖培养基，置于30～35℃培养箱培养18～24小时。
试验组和阴性菌胆盐乳糖培养18～24小时之后，取上述培养物分别划线接种至溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，培养18～24小时。
2.3.3.2结果
试验组的溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基上长出典型的铜绿假单胞菌菌落，试验组检出铜绿假单胞菌菌落。
阴性菌对照组的溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基上未见菌落生长。阴性菌对照组未检出铜绿假单胞菌。
2.3.4金黄色葡萄球菌检查方法验证
2.3.4.1试验组 ：取1:20的供试液20ml及10～100CFU的金黄色葡萄球菌菌悬液接种至500ml营养肉汤培养基，置于30～35℃培养箱培养18～24小时。阴性菌对照组：取1:20的供试液20ml及10～100CFU的大肠埃希菌菌悬液接种至500ml营养肉汤培养基，置于30～35℃培养箱培养18～24小时。
取上述试验组和阴性菌对照组在营养肉汤培养基中的培养物分别划线接种至甘露醇氯化钠脂琼培养基平板，30～35℃培养箱培养24～72小时。
2.3.4.2结果
试验组的甘露醇氯化钠脂琼培养基上长出典型的金黄色葡萄球菌菌落，试验组检出金黄色葡萄球菌。阴性菌对照组的甘露醇氯化钠脂琼培养基上未见菌落生长，阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌。
2.4验证结果
本品按《中华人民共和国药典》2010年版（一部）微生物限度检查方法进行验证，结果符合规定。
2.5讨论
2.5.1.当供试品具有抑菌活性时，可采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等消除，其中以培养基稀释法较为方便简单，因此，在本实验中出现对细菌、霉菌均有较强的抑菌作用时，采用培养基稀释法。
  2.5.2.在做微生物限度检查时，供试液的制备样品应充分分散、振摇，溶解，使其中的微生物分散均匀，确保同级别的2个平皿中菌落数的差值在允许范围内。
参考文献
 [1] 国家药典委员会编：中国药典一部 [M]. 北京：中国医药科技出版社.2010附录79