石娜娜1 王波1 王玉芳1 高坤2

1潍坊工程职业学院 山东青州 262500

2中华人民共和国潍坊出入境检验检疫局 山东青州 262500

摘要：由单因素和正交实验优化得到了P-24菌株的高密度发酵培养基配方（g/L）：蔗糖25，柠檬酸钠3，乙酸钠2，酵母粉8，蛋白胨5，玉米浆20，MgSO4*7H2O 0.4，K2HPO4 1.0，pH 6.2-6.6。通过3L发酵罐小试，发酵过程中进行pH的调节和补糖，乳酸片球菌P-24的生物量提高了9倍，有效活菌数达9×1010 CFU/mL。

关键词：乳酸片球菌；生物量；培养基优化；

乳酸片球菌乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，P.a）是一种动物体内的益生菌，是一种常见的乳酸菌[1]。可直接应用于动物饲料、动物喂食和青贮饲料中。在饲料中能抑制腐败微生物的生长，解决饲料腐败问题，提高饲料适口性和消化率[1]。乳酸片球菌在香肠发酵中具有较高的竞争性和环境适应性[2]。其在肉制品发酵中产酸，使pH下降，赋予其特有的风味；另外乳酸片球菌产生的各种酶类物质，可使肉中的蛋白质分解为人体易吸收的物质，提高其产品的营养价值[3-4]。

目前对乳酸片球菌的研究主要集中在生产应用领域，但对发酵工艺方面的研究却很少，大部分用传统MRS培养基进行发酵，但它的成本高，活菌数少，本实验对P-24的培养基进行了优化，降低了生产成本，有效提高了活菌数。

1 材料和方法

1.1 菌种

乳酸片球菌C1C-1241，潍坊工程职业学院生化学院保藏菌种。

1.2 培养基

出发培养基为MRS培养基（g/l）：葡萄糖20、蛋白胨10、酵母粉5、柠檬酸氢二铵2、乙酸钠5、磷酸氢二钾2、硫酸镁0.58、硫酸锰0.25。

1.3 生物量的检测

在600nm处对菌体溶液进行比色，根据浊度判定生物量。

1.4 单因素优化

将MRS培养基中的葡萄糖，替换为蔗糖、麦芽糖、乳糖及液化淀粉；柠檬酸氢二铵替换为柠檬酸钠；蛋白胨+酵母粉替换为酵母粉、蛋白胨、玉米浆、蛋白胨+酵母粉、酵母粉+玉米浆、酵母粉+蛋白胨+玉米浆，确定最佳碳源和氮源。

向MRS培养基中添加不同浓度的硫酸镁、磷酸氢二钾和硫酸锰，确定最佳无机盐种类和浓度。

1.5 正交优化试验

在单因素实验的基础上，选择蔗糖、蛋白胨、柠檬酸钠设计三因素三水平正交实验，优化发酵培养基的配方。

表1 正交实验设计

水平 因素

A蔗糖(g/L) B柠檬酸钠(g/L) C蛋白胨(g/L)

1 20.0 1.0 5.0

2 25.0 2.0 10.0

3 30.0 3.0 15.0

 

1.6 3L发酵罐初始试验

用优化后的培养基在3L发酵罐中初试，发酵过程中用8mol/L的NaOH控制发酵液pH在5.5—6.5之间。

2 结果与讨论

2.1 单因素优化结果

2.1.1最佳碳源、氮源

以蔗糖为碳源时，OD600为4.043，选择蔗糖作为最佳碳源。以酵母粉+蛋白胨+玉米浆为氮源时OD600值3.281，与蛋白胨+酵母粉相差无异，但考虑到生产成本，选择酵母粉+蛋白胨+玉米浆作为氮源。

柠檬酸氢二铵成本较高，为降低成本，用等量的柠檬酸钠将其代替，通过生物量的比较发现，能提高其生物量OD600为3.521。

2.1.2最佳无机盐种类及浓度

添加0.4g/L的Mg2+时发酵液的生物量最大，OD600为3.500；添加1g/L的K2HPO4时发酵液的生物量最大，OD600为3.728；Mn2+不利P-24的发酵，不添加。

2.2 正交优化试验结果

根据上述单因素实验结果，进行蔗糖、柠檬酸钠和蛋白胨三因素正交实验，各因素影响顺序为蛋白胨>柠檬酸钠>蔗糖，最优组合为A2B3C1。可得到优化的发酵培养基为(g/L)：蔗糖25，柠檬酸钠3，乙酸钠2，蛋白胨5，酵母粉5，玉米浆12，磷酸氢二钾1，硫酸镁0.4，此配方下生物量OD600为4.700。

2.3 3L发酵罐初试及结果

将优化后培养基在3L发酵罐上初试，6h后通过级联控制滴加NaOH，使pH在5.5—6.0以及6.0-6.5范围内波动，直至发酵结束，选择最适pH范围。 

A：PH 6.0～6.5 B：PH 5.5～6.0 C：CK(未调PH值)

图 发酵过程中生物量、残糖变化

从图可以看出，该菌pH从0~8h一直在下降，而控制发酵液pH可以提高菌体生物量。当pH在5.5~6.0时，更适合菌体的生长，此时OD600为11.820，有效活菌数为6.8*1010CFU/ml。

在发酵培养至8h时开始补料，向发酵罐中一次补入10mL葡萄糖溶液，之后每隔2h进行一次补料，共补料3次，发酵至25h结束，此时P-24有效活菌数为90亿/mL，菌体OD600为13.5~14.0。

3 结论

乳酸片球菌在动物饲料、青贮饲料、食品等方面均有重要的应用价值，采用优化后的发酵培养基并再发酵过程中控制pH，提高了乳酸片球菌的菌体量，优化后的培养基配方及发酵方法对其生物菌剂的生产提供了重要参考。

参考文献

[1]凌代文，1999，乳酸细菌分类鉴定及实验方法.中国轻工业出版社

[2]杨华，发酵剂及抗氧化剂对鲶鱼发酵香肠品质的影响，食品与发酵工业，2010